Mi experiencia

En este blog decidí hablar  de la preparación de los medios de cultivo que son utilizados en  bacteriología.

La bacteriología  se estudia  en la carrera de Licenciatura en Laboratorio Clínico, de la cual me gradué.
 El Laboratorio clínico,  es un área medica muy bonita de la cual me siento muy orgullosa de pertenecer y por supuesto trabajar en la preparación de los medios de cultivo y su utilización.

La buena preparación de los medios de cultivo nos ayuda para poder dar un buen diagnóstico y tratamiento  a los pacientes, tanto adultos como niños.

Con la  preparación de los medios de cultivo he obtenido muchos tipos de bacterias, las cuales podemos identificar en equipos automatizados. 

Podemos encontrar bacterias como:  Escherichia coli,  que son bacilos Gram negativos y  Staphylococcus sp. que son cocos Gram positivos.

                                                                               

Bacilos Gram negativos.

               

Bacilos Gram positivos.

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Tioglicolato

Caldo de tioglicolato

Es un medio líquido de enriquecimiento para crecimiento bacteriológico.


Componentes:

Peptona------------------------------------ 20 grs.

Lecitina------------------------------------ 0.25 grs.

Glucosa------------------------------------ 6 grs.

Cloruro de sodio------------------------- 2.5 grs.

Tioglicolato de sodio-------------------- 0.5 grs.

Sulfito de sodio--------------------------- 0.1 grs.

Agar----------------------------------------- 0.7 grs.

Agua destilada--------------------------- 1000 mL


Preparación:

 Disolver 30 grs. en 1000 mL de agua desmineralizada.

Dispensar en tubos de tapón de rosca, aproximadamente 5 mL del caldo, luego autoclavear a 121ºC por 15 minutos.

Caldo de tioglicolato.

Equipo

Material y equipo para preparaduría.

Sangre de carnero.

Proteínas para el medio de chocolate.

Balones y Erlenmeyer.

Placas Petrí.

Balanza.

Caldo.

Tripticasa soya.

Medio de cultivo para el crecimiento de las bacterias.

 
Contenido:

 Tripticasa------------------ 17 grs.
  Pheptone------------------- 3 grs.
  Cloruro de sodio--------- 5 grs.
  Fosfato dipotásico------- 2.5 grs.
  Glucosa-------------------- 2.5 grs.
  Agua destilada----------- 1000 mL

  Preparación:

 30grs ------------------- 1000 mL de agua destilada

Dispensar el medio en tubos con tapón de rosca de 10-15 mL y esterilizar a 15 lb. de presión durante 15 minutos.

Caldo de tripticasa soya.

Chocolate.

Agar.

Este es un medio enriquecido, que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias.

Componentes:

  Hemoglobina (BBL;DIFCO;OXOID)
  Suplemento nutritivo o proteínas
  Agua destilada  

Preparación :

GC médium para 500 mL pesar 36 grs.

Hemoglobina para 500 mL pesar 10 grs.

Se coloca el medio ya disuelto por 30 minutos en un rotador de serología. Después, calentarlo a que de un hervor aproximadamente. Se pone en el autoclave por separado GCM (en dos balones) y la hemoglobina; se dan unos 4 dobleces a la gasa y ésta se coloca en un embudo esterilizado previamente,  la gasa en el embudo  filtra la hemoglobina para quitarle los escombros. Agregarlo al GCM y se espera a que se enfrié y luego se le agrega el Bacto Suplemento VX y se vierte en las placas.  

         

Proteínas.

proteinas o suplementos.

Placas de Agar Chocolate.

Medio sólido.

Agar tripticasa soya.

Es un medio útil para el aislamiento y mantenimiento de casi todos los microorganismos, además es excelente como base para agar sangre,  este medio es usado para el aislamiento y estudio de microorganismos, ya sea que posee la capacidad hemolítica haciéndolo un medio diferencial.

Componentes:

  Medio base para agar sangre---------- 40 grs.

  Agua destilada----------------------------- 1000 mL

  Sangre de carnero 5%------------------- 50 cc.

   Preparación:

Dejar enfriar el medio ya estéril a 45ºC – 50 ºC, posteriormente añadir 50 cc de sangre de carnero 5% estéril a 1000 ml del medio y mezclar suavemente, luego verter en placas de Petri estériles aproximadamente 15 cc en cada placa de Petri.

La preparación debe realizarse en un cuarto cerrado y en un área cerca del mechero para evitar contaminación en las placas.

Finalmente se rotulan las placas colocando la fecha de elaboración y el número de lote .

 

Sangre de carnero al 5%

Placas de agar sangre.

 

MacConkey

Agar macConkey.

Es un medio en el cual las bacterias lactosa positiva forman colonias color rosado y las lactosa negativas forman colonias incoloras.
Sirve para el aislamiento de Salmonella, Shigella y bacterias coliformes.
Es un medio selectivo y diferencial. Selectivo porque solo crecen bacilos gramnegativos y diferencial porque separa los fermentadores de la lactosa  no fermentadores.


Componentes:

 Peptona de caseina ------------- 17 grs.
Peptona de carne------------------ 3.0 grs.
Cloruro sódico--------------------- -5.0 grs.
Lactosa------------------------------ -10 grs.
Mezcla de sales biliares-------- -1.5 grs.
Rojo neutro-------------------------- 0.03 grs.
Violeta cristal-------------------------0.001 grs.




 Preparación:

 Disolver 50 grs. del medio de cultivo en un litro de agua desmineralizada, calentando en un baño de agua hirviendo, tratar en el autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.

Dispensar 15ml del medio en placas de Petri pequeñas de 16x91 y realizar la prueba de esterilidad poniéndola en la estufa por 24 horas, también debe inocularse en otra placa una cepa conocida de lactosa positiva y otra de lactosa negativa para probar la capacidad diferencial que tiene el medio.

 

Placas de Agar MacConkey.

Medios refrigerados.

Urea

Caldo.

Este medio líquido  se utiliza  para demostrar la producción de ureasa por especies del género Proteus. También sirve para detectar cantidades pequeñas de ureasa producidas por otras bacterias entéricas, diferenciándolas de la Shigella y Salmonella que son ureasa negativa, además se utiliza para identificar las especies de Cryptococcus que son ureasa positiva.

Contenido:

Urea --------------------------------- 20 grs.
Fosfato mono potásico ---------- 9.1 grs.
Fosfato di sódico ------------------ 9.5 grs.
Extracto de levadura ------------ 0.1 grs.
Rojo fenol -------------------------- 0.01 grs.
Agua destilada ------------------- 1000 ml

Preparación:

3.87 grs ---- 100 ml de agua destilada (no hervir)

Autoclaviar primero los tubos  y luego colocar 2 mL en cada tubo de rosca del medio ya preparado.

Calado de Urea.

 

Esterilidad.

Se lleva un control de esterilidad de placas de medios de cultivo, dicho control se realiza en cada preparación, por ejemplo: las placas de Agar Sangre y MacConkey se incuban a 36 ± 1ºC por 24 horas, posteriormente los resultados se anotarán en la hoja de registro correspondiente.
Todas las placas que se preparan se debe identificar con el número de lote y la fecha de preparación, las placas se van utilizando según la fecha en que han sido elaboradas, dejando en reserva las de fecha mas reciente y utilizando las de fechas mas antiguas. Además se realizan controles de crecimiento de cepas ATCC conocidas .

En un placa de Agar sangre se siembra una cepa  ATCC de cocos

 (Staphylococcous aureus).

y en otra placa de MacConkey sembrar una cepa ATCC de un bacilo

 ( Escherichia coli).

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Medios refrigerados listos para usar.

Bacilos Gram negativos.  

Lactosa positiva.

 Cocos Gram positivos.

  Cocos Gram positivos.

Citrato.

Agar citrato.

Este medio es usado para estudiar la capacidad de utilización de citrato, como única fuente de carbono por las bacterias.

Contenido:

Agar(medio solido)--------------------------- 20 grs.
Cloruro de sodio------------------------------- 5 grs.
Sulfato de magnesio---------------------------0.2 grs.
Fosfato deshidrogenado de amonio ------1 gr.
Fosfato dipotásico------------------------------1gr.
Citrato de sodio---------------------------------2 grs.
Azul de bromo timol----------------------------0.08 grs.
Agua destilada-----------------------------------1000 mL

Preparación:

 
Disuelva el medio y dispénselo en tubos con tapón de rosca, inclinarlos para que se forme el bisel.

Control de calidad:

 

  A. control positivo :   Enterobacter aerogenes.
  B. Control negativo : Escherichia coli.

 

Citrato.

    

Tsi.

Agar tres azúcares y hierro (TSI)

Este medio se utiliza para determinar la fermentación de carbohidratos y la producción de sulfuro de hierro, como el primer paso en la identificación de los bacilos Gramnegativos.


Contenido:

Peptona -------------------------------- 20 grs.
Cloruro de sodio --------------------- 5 grs.
Lactosa --------------------------------- 10 grs.
Sucrosa -------------------------------- 10 grs.
Glucosa -------------------------------- 1 gr.
Sulfato de amonio ferroso --------- 0.2 grs.
Trisulfato de sodio ------------------- 0.2 grs.
Rojo fenol ------------------------------ 0.025 grs.
Agar ------------------------------------- 13 grs.
Agua destilada ------------------------ 1000 ml


Preparación:

Disolver el medio y dispensar en tubos con tapón de rosca. Esterilizar a 15 ºC durante 15 minutos, una vez esterilizados deben colocarse inclinados para que se forme el bisel.
 

Agar tres Azúcares y hierro.

Virtiendo.

  Medio en placas.

Generalidades.

Los medios de cultivo pueden prepararse utilizando los ingredientes que se detallan en la fórmula respectiva o usando medios deshidratados comerciales (BBL, DIFCO;MERCK, etc.). Se debe pesar las cantidades específicas de cada medio de cultivo y disolverlas en agua destilada utilizando un Erlenmeyer de tamaño adecuado, para la disolución es necesario agitar y calentar el medio hasta ebullición, procurando que no se queme ni se derrame. El calentamiento puede hacerse en un mechero, cocina o baño de maría; la agitación del medio se hace con la mano enguantada tomando el Erlenmeyer por el cuello y realizando movimientos rotatorios (el medio bien disuelto es transparente y no granular). Si el medio se va a dispensar en tubos debe hacerse antes de esterilizarlo usando un Becker o un embudo.

Si se va a dispensar el medio en placas de Petri, éste debe esterilizarse en un Erlenmeyer, luego dejarlo enfriar a 50ºC aproximadamente para evitar que se forme vapor de condensación en las placas.

El vaciado del medio requiere algunos ingredientes termolábiles como sangre, suero, carbohidratos, urea, etc. ;estos deben agregarse después que el medio ha sido esterilizado y enfriado a 45ºC ó 50 ºC, excepto cuando se prepara agar chocolate ya que entonces la sangre se agrega cuando el medio esta a 80ºC.
Es de suma importancia en la preparación de cada medio el esterilizarlo con la técnica que se especifique en las instrucciones, incluyendo temperatura y el tiempo indicado. Alteraciones en la esterilización puede arruinar el medio e impedir que proporcione un servicio satisfactorio.

Los medios preparados deben guardarse en la refrigeradora convenientemente identificados con la fecha de preparación y el número de lote.

 Erlenmeyer.

 Placas Petri.

 Esterilizador.

  Preparación de medios de cultivo.

Frascos

La preparaduría es básica para proporcionar los medios necesarios en el área de bacteriología por la que su calidad debe ser estrictamente buena para garantizar que los resultados sean fidedignos, así  de esta manera estaremos contribuyendo a un buen diagnóstico y tratamiento  de la paciente y el recién nacido.

La preparación de los medios de cultivos se realiza a partir  medios deshidratados siguiendo las instrucciones que vienen en cada uno de los frascos.

Frascos de medios de cultivo.