Los medios de cultivo pueden prepararse utilizando los ingredientes que se detallan en la fórmula respectiva o usando medios deshidratados comerciales (BBL, DIFCO;MERCK, etc.).
Se debe pesar las cantidades específicas de cada medio de cultivo y disolverlas en agua destilada utilizando un Erlenmeyer de tamaño adecuado, para la disolución es necesario agitar y calentar el medio hasta ebullición, procurando que no se queme ni se derrame. El calentamiento puede hacerse en un mechero, cocina o baño de maría; la agitación del medio se hace con la mano enguantada tomando el Erlenmeyer por el cuello y realizando movimientos rotatorios (el medio bien disuelto es transparente y no granular).
Si el medio se va a dispensar en tubos debe hacerse antes de esterilizarlo usando un Becker o un embudo.
Si se va a dispensar el medio en placas de Petri, éste debe esterilizarse en un Erlenmeyer, luego dejarlo enfriar a 50ºC aproximadamente para evitar que se forme vapor de condensación en las placas. El vaciado del medio requiere algunos ingredientes termolábiles como sangre, suero, carbohidratos, urea, etc. ;estos deben agregarse después que el medio ha sido esterilizado y enfriado a 45ºC ó 50 ºC, excepto cuando se prepara agar chocolate ya que entonces la sangre se agrega cuando el medio esta a 80ºC.
Es de suma importancia en la preparación de cada medio el esterilizarlo con la técnica que se especifique en las instrucciones, incluyendo temperatura y el tiempo indicado. Alteraciones en la esterilización puede arruinar el medio e impedir que proporcione un servicio satisfactorio.
Los medios preparados deben guardarse en la refrigeradora convenientemente identificados con la fecha de preparación y el número de lote.
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